The present invention relates to a vector for expression of a heterologous
protein by a Gram negative bacteria, wherein the vector includes a nucleic
acid such as DNA encoding the following: an origin of replication region;
optionally and preferably a selection marker; a promoter; an initiation
region such as translation initiation region and/or a ribosome binding
site, at least one restriction site for insertion of heterologous nucleic
acid, e.g. DNA, encoding the heterologous protein, and a transcription
terminator. The inventive vector may contain DNA encoding the heterologous
protein, e.g., pro-insulin such as pro-insulin with a His tag.
Additionally, the invention provides a method for extracting a recombinant
protein from within a recombinant Gram negative bacteria having a cell
membrane, without lysing the bacteria, as well as a method for purifying
an isolated recombinant human insulin, wherein the isolated recombinant
human pro-insulin is subjected to sulfitolysis, Ni-chelation
chromatography, renaturation, limited proteolysis and chromatography
separation to provide purified, isolated, recombinant human insulin.
Присытствыющий вымысел относит к вектору для выражения гетерологичного протеина бактериями грамма отрицательными, при котором вектор вклюает нуклеиновую кислоту such as ДНАО шифруя following: начало зоны репликации; опционно и предпочтительн отметка выбора; promoter; зона начала such as зона начала перевода and/or связующий сайт рибосомы, по крайней мере одно место ограничения для ввода гетерологичной нуклеиновой кислоты, например ДНАА, зашифрования гетерологичный протеин, и терминатора транскрипции. Изобретательный вектор может содержать ДНАО шифруя гетерологичный протеин, например, про-insulin such as про-insulin с его биркой. Дополнительно, вымысел обеспечивает метод для извлекать рекомбинатный протеин от внутри бактерий рекомбинатного грамма отрицательных имея мембрану клетки, без лизировать бактерии, также,как метод для очищать изолированный рекомбинатный людской инсулин, при котором изолированный рекомбинатный людской про-insulin подвергается к sulfitolysis, хромотографии Ни-ni-chelation, renaturation, лимитированному протеолизу и разъединению хромотографии для того чтобы обеспечить после того как он очищен, изолированный, рекомбинатный людской инсулин.
