The activity of intracellular chemical reactions of molecules is measured
by the use of fluorescently labeled substrate molecules that undergo a
change in electrophoretic mobility upon chemical reaction such as that
catalyzed by an enzyme. Specificity is achieved by using labeled substrate
molecules that can be acted upon only by specific enzymes. Thus the
activity of a specific enzyme or class of enzymes can be determined.
Measurements are made with the intracellular presence of such substrate
molecules, at some time of interest, typically after exposure of the cell
to a stimulus that activates a particular enzymatic pathway. To ensure
accuracy, measurements must be made in a timely manner so as to minimize
chemical reactions occurring subsequent to the time of interest. Fast
controllable laser lysis is used to obtain the contents of a single cell
into which reporter substrate molecules have been introduced. The cell
contents are then subjected to capillary electrophoresis and enzymatic
activity is determined by comparing amounts of substrate molecules to
amounts of enzymatically altered substrate molecules which are separated
by the electrophoresis and identified by the presence of a fluorescent
label.
Η δραστηριότητα των ενδοκυτταρικών χημικών αντιδράσεων των μορίων μετριέται με την χρήση των fluorescently επονομαζόμενων μορίων υποστρωμάτων που υποβάλλονται σε μια αλλαγή στην ηλεκτροφορητική κινητικότητα επάνω στη χημική αντίδραση όπως αυτή που καταλύεται από ένα ένζυμο. Η ιδιομορφία επιτυγχάνεται με τη χρησιμοποίηση των επονομαζόμενων μορίων υποστρωμάτων που μπορούν επάνω μόνο από τα συγκεκριμένα ένζυμα να ενεργήσουν. Κατά συνέπεια η δραστηριότητα ενός συγκεκριμένης ενζύμου ή μιας κατηγορίας ενζύμων μπορεί να καθοριστεί. Οι μετρήσεις γίνονται με την ενδοκυτταρική παρουσία τέτοιων μορίων υποστρωμάτων, σε κάποιο χρόνο ενδιαφέροντος, χαρακτηριστικά μετά από την έκθεση του κυττάρου σε ένα ερέθισμα που ενεργοποιεί μια ιδιαίτερη ενζυματική διάβαση. Για να εξασφαλίσουν ακρίβεια, οι μετρήσεις πρέπει να γίνουν κατά τρόπο έγκαιρο ώστε να ελαχιστοποιηθεί η χημική εμφάνιση αντιδράσεων επόμενη στο χρόνο ενδιαφέροντος. Η γρήγορη ελέγξιμη λύση λέιζερ χρησιμοποιείται για να λάβει το περιεχόμενο ενός μονού κυττάρου στο οποίο τα μόρια υποστρωμάτων δημοσιογράφων έχουν εισαχθεί. Το περιεχόμενο κυττάρων υποβάλλεται έπειτα στην τριχοειδή ηλεκτροφόρηση και η ενζυματική δραστηριότητα καθορίζεται με τη σύγκριση των ποσών μορίων υποστρωμάτων με τα ποσά enzymatically αλλαγμένων μορίων υποστρωμάτων που χωρίζονται από την ηλεκτροφόρηση και προσδιορίζονται από την παρουσία μιας φθορισμού ετικέτας.