The present invention relates to a method for detecting the amount of a target polynucleotide in a sample. A combination is provided in a medium. The combination comprises (i) a sample suspected of containing the target polynucleotide, the target polynucleotide being in single stranded form, (ii) a reference polynucleotide comprising a sequence that is common with a sequence of the target polynucleotide, and (iii) a predetermined amount of an oligonucleotide probe that has a sequence that hybridizes with the sequence that is common. The combination is subjected to conditions for amplifying the target polynucleotide and the reference polynucleotide. The conditions permit formation of substantially non-dissociative complexes of the target polynucleotide and the reference polynucleotide, respectively, with the oligonucleotide probe. Furthermore, the predetermined amount of the oligonucleotide probe is less than the expected amount of the amplified target polynucleotide. The ratio of the amount of the complex of the target polynucleotide with the oligonucleotide probe to the amount of the complex of the reference polynucleotide with the oligonucleotide probe is determined. Determination of the ratio is facilitated by employing second and third oligonucleotide probes. The second oligonucleotide probe has a sequence that hybridizes only with the second sequence of the target polynucleotide. The third oligonucleotide probe has a sequence that hybridizes only with a respective second sequence of the reference polynucleotide. The ratio is related to the known amount of the reference polynucleotide to determine the amount of the target polynucleotide in the sample. One or more reference polynucleotides may be employed with a corresponding third oligonucleotide probe for each reference probe. Kits for carrying out the above methods are also disclosed. The method is particularly applicable to the amplification and detection of RNA.

La presente invenzione riguarda un metodo per la rilevazione della quantità di polynucleotide dell'obiettivo in un campione. Una combinazione è fornita in un mezzo. La combinazione contiene (i) un campione ha ritenuto sospetto di contenere il polynucleotide dell'obiettivo, il polynucleotide dell'obiettivo che è nella singola forma incagliata, (ii) un polynucleotide di riferimento che contengono una sequenza che è comune con una sequenza del polynucleotide dell'obiettivo e (iii) un la quantità predeterminata di sonda del oligonucleotide che ha una sequenza che ibrida con la sequenza che è comune. La combinazione è sottoposta ai termini per l'amplificazione il polynucleotide dell'obiettivo e del polynucleotide di riferimento. Le circostanze consentono la formazione dei complessi sostanzialmente non-dissociative del polynucleotide dell'obiettivo e del polynucleotide di riferimento, rispettivamente, con la sonda del oligonucleotide. Ancora, la quantità predeterminata della sonda del oligonucleotide è di meno che la quantità prevista del polynucleotide amplificato dell'obiettivo. Il rapporto della quantità del complesso del polynucleotide dell'obiettivo con la sonda del oligonucleotide alla quantità del complesso del polynucleotide di riferimento con la sonda del oligonucleotide è determinato. La determinazione del rapporto è facilitata impiegando in secondo luogo e dalle terze sonde del oligonucleotide. La seconda sonda del oligonucleotide ha una sequenza che ibrida soltanto con la seconda sequenza del polynucleotide dell'obiettivo. La terza sonda del oligonucleotide ha una sequenza che ibrida soltanto con una seconda sequenza rispettiva del polynucleotide di riferimento. Il rapporto è collegato con la quantità conosciuta del polynucleotide di riferimento per determinare la quantità del polynucleotide dell'obiettivo nel campione. Uno o più polynucleotides di riferimento possono essere impiegati con una terza sonda corrispondente del oligonucleotide per ogni sonda di riferimento. I corredi per l'avanzamento dei metodi suddetti inoltre sono rilevati. Il metodo è particolarmente applicabile all'amplificazione ed alla rilevazione di RNA.