Imaging hardware, software, calibrants, and methods are provided to
visualize and quantitate the amount of Fluorescence Resonance Energy
Transfer (FRET) occurring between donor and acceptor molecules in
epifluorescence microscopy. The MicroFRET system compensates for overlap
among donor, acceptor, and FRET spectra using well characterized
fluorescent beads as standards in conjunction with radiometrically
calibrated image processing techniques. The MicroFRET system also provides
precisely machined epifluorescence cubes to maintain proper image
registration as the sample is illuminated at the donor and acceptor
excitation wavelengths. Algorithms are described that pseudocolor the
image to display pixels exhibiting radiometrically-corrected fluorescence
emission from the donor (blue), the acceptor (green) and FRET (red). The
method is demonstrated on samples exhibiting FRET between genetically
engineered derivatives of the Green Fluorescent Protein (GFP) bound to the
surface of Ni chelating beads by histidine-tags.
De hardware, de software, calibrants, worden en de methodes van de weergave verstrekt om en de hoeveelheid Overdracht die van de Resonantie-energie te visualiseren te kwantificeren van de Fluorescentie (LIJSTWERK) tussen donor en acceptormolecules in de epifluorescencemicroscopie voorkomt. Het systeem MicroFRET compenseert overlapping onder donor, acceptor, en de spectrums van het LIJSTWERK gebruikend goed gekenmerkte fluorescente parels als normen samen met de radiometrically gekalibreerde technieken van de beeldverwerking. Het systeem MicroFRET verstrekt ook precies machinaal bewerkte epifluorescencekubussen om juiste beeldregistratie te handhaven aangezien de steekproef bij de donor en acceptoropwindingsgolflengten verlicht is. De algoritmen worden beschreven die pseudocolor het beeld aan vertoningspixel die radiometrically-verbeterde fluorescentieemissie van de (blauwe) tentoonstellen donor, de (groene) acceptor en (rood) LIJSTWERK. De methode wordt aangetoond op steekproeven tentoonstellend LIJSTWERK tussen genetisch gebouwde derivaten van de Groene Fluorescente Proteïne (GFP) verbindend aan de oppervlakte van chelating parels van Ni door histidine-markeringen.
