Disclosed are compositions and a method for of amplifying nucleic acid
sequences useful for detecting the presence of molecules of interest. The
method is useful for detecting specific nucleic acids in a sample with
high specificity and sensitivity. The method also has an inherently low
level of background signal. A preferred form of the method consists of a
DNA ligation operation, an amplification operation, and a detection
operation. The DNA ligation operation circularizes a specially designed
nucleic acid probe molecule. This operation is dependent on hybridization
of the probe to a target sequence and forms circular probe molecules in
proportion to the amount of target sequence present in a sample. The
amplification operation is rolling circle replication of the circularized
probe. A single round of amplification using rolling circle replication
results in a large amplification of the circularized probe sequences.
Following rolling circle replication, the amplified probe sequences are
detected and quantified using any of the conventional detection systems
for nucleic acids such as detection of fluorescent labels, enzyme-linked
detection systems, antibody-mediated label detection, and detection of
radioactive labels. Because, the amplified product is directly
proportional to the amount of target sequence present in a sample,
quantitative measurements reliably represent the amount of a target
sequence in a sample. Major advantages of this method are that the
ligation step can be manipulated to obtain allelic discrimination, the DNA
replication step is isothermal, and signals are strictly quantitative
because the amplification reaction is linear and is catalyzed by a highly
processive enzyme. In multiplex assays, the primer oligonucleotide used
for the DNA polymerase reaction can be the same for all probes. Also
described are modes of the method in which additional amplification is
obtained using a cascade of strand displacement reactions.
Onthuld worden de samenstellingen en een methode voor van het vergroten van nucleic zuuropeenvolgingen nuttig om de aanwezigheid van molecules van belang te ontdekken. De methode is nuttig om specifieke nucleic zuren in een steekproef met hoge specificiteit en gevoeligheid te ontdekken. De methode heeft ook een inherent laag niveau van achtergrondsignaal. Een aangewezen vorm van de methode bestaat uit een de afbindingsverrichting van DNA, een versterkingsverrichting, en een opsporingsverrichting. De de afbindingsverrichting van DNA stuurt een speciaal ontworpen molecule van nucleic zuursonde een rondschrijven. Deze verrichting is afhankelijk bij de kruising van de sonde aan een doelopeenvolging en vormt cirkelsondemolecules in verhouding tot de hoeveelheid doelopeenvolging huidig in een steekproef. De versterkingsverrichting rolt cirkelreplicatie van de een rondschrijven gestuurde sonde. Één enkele ronde die van versterking rollende cirkelreplicatie gebruikt resulteert in een grote versterking van de een rondschrijven gestuurde sondeopeenvolgingen. Na rollende cirkelreplicatie, worden de vergrote sondeopeenvolgingen ontdekt en gebruikend om het even welk van de conventionele opsporingssystemen voor nucleic zuren zoals opsporing van fluorescente etiketten, enzym-verbonden opsporingssystemen, antilichaam-bemiddelde etiketopsporing, en opsporing van radioactieve etiketten gekwantificeerd. Omdat, het vergrote product aan de hoeveelheid doelopeenvolging huidig in een steekproef direct evenredig is, vertegenwoordigen de kwantitatieve metingen betrouwbaar de hoeveelheid doelopeenvolging in een steekproef. De belangrijke voordelen van deze methode zijn dat de afbindingsstap kan worden gemanipuleerd om allelic onderscheid te verkrijgen, is de de replicatiestap van DNA isothermisch, en de signalen zijn strikt kwantitatief omdat de versterkingsreactie lineair is en door een hoogst processive enzym gekatalyseerd. In samengestelde analyses, inleidings kan wordt gebruikt oligonucleotide die voor de de polymerasereactie van DNA het zelfde voor alle sondes zijn. Ook beschreven worden de wijzen van de methode waarin de extra versterking gebruikend een cascade van bundelverdringingsreacties wordt verkregen.
