Eukaryotic cells have evolved a mechanism that delays the onset of anaphase until chromosomes are properly positioned on the spindle. To understand the molecular basis of such surveillance mechanism in human cells, we have cloned a full-length cDNA encoding a putative mitotic checkpoint kinase termed hBub1. Sequence comparison reveals that hBub1 is a structurally conserved protein, sharing 23% amino acid residue identity with BUB1 of budding yeast. In addition, the N-terminal portion (161 amino acids) of hBub1 shows a significant homology to yeast MAD3, a protein also known to be involved in the mitotic checkpoint response pathway. Northern blot analyses show that hBub1 mRNA level is abundantly expressed in tissues or cells with a high mitotic index. When Dami cells undergoes terminal differentiation following treatment with phorbol ester, hBub1 expression in this cell line is rapidly downregulated. The hBub1 protein level is low in G1 and remains relatively constant in S, G2 and M phases. Immunofluorescence analysis shows that hBub1 protein co-localizes with a centromere-kinetochore antigen CREST in interphase, mitotic prophase and nocodazole-treated cells. Antibody electroporation experiments show that hBub1 is an important component of the spindle checkpoint pathway. Furthermore, fluorescence in situ hybridization analysis maps the hBub1 gene to chromosome 2q12-13. Our studies suggest that hBub1 expression is restricted to proliferating cells and appears to be involved in regulating cell-cycle progression. The molecular cloning of hBub1 cDNA will facilitate the study of its role in spindle checkpoint control as well as its potential role in certain genetic disorders.

Τα ευκαριωτικά κύτταρα έχουν εξελίξει έναν μηχανισμό που καθυστερεί την αρχή της ανάφασης έως ότου τοποθετούνται κατάλληλα τα χρωμοσώματα στον άξονα. Για να καταλάβουμε τη μοριακή βάση τέτοιου μηχανισμού επιτήρησης στα ανθρώπινα κύτταρα, έχουμε κλωνοποιήσει ένα ολόκληρο DNA κωδικοποιώντας μια υποθετική mitotic κινάση σημείων ελέγχου που καλείται hBub1. Η σύγκριση ακολουθίας αποκαλύπτει ότι hBub1 είναι μια δομικά συντηρημένη πρωτεϊ'νη, μοιραμένος την ταυτότητα υπολειμμάτων αμινοξέος 23% με BUB1 της βλαστάνοντας ζύμης. Επιπλέον, η ν-τελική μερίδα (161 αμινοξέα) hBub1 παρουσιάζει σημαντική ομολογία στη ζύμη MAD3, μια πρωτεϊ'νη που είναι γνωστή επίσης για να περιλαμβάνεται στη mitotic διάβαση απάντησης σημείων ελέγχου. Οι βόρειες αναλύσεις λεκέδων δείχνουν ότι το επίπεδο hBub1 mRNA εκφράζεται άφθονα στους ιστούς ή τα κύτταρα με έναν υψηλό mitotic δείκτη. Όταν τα κύτταρα Dami υποβάλλονται στην τελική διαφοροποίηση μετά από την επεξεργασία με τον εστέρα phorbol, η έκφραση hBub1 σε αυτήν την γραμμή κυττάρων είναι γρήγορα. Το πρωτεϊνικό επίπεδο hBub1 είναι χαμηλό G1 και παραμένει σχετικά σταθερό στις φάσεις του s, G2 και μ. Η ανάλυση ανοσοφθορισμού δείχνει ότι η πρωτεϊ'νη hBub1 ομο-εντοπίζει με μια CREST αντιγόνων κεντρομεριδίων -κεντρομερίδιο-κηνετοθχορε στην ενδιάμεση φάση, το mitotic prophase και τα νοθοδαζολε-αντιμετωπισμένα κύτταρα. Τα πειράματα ηλεκτρομετασχηματισμού αντισωμάτων δείχνουν ότι hBub1 είναι ένα σημαντικό συστατικό της διάβασης σημείων ελέγχου αξόνων. Επιπλέον, η κανονική ανάλυση υβριδοποίησης φθορισμού χαρτογραφεί το γονίδιο hBub1 στο χρωμόσωμα 2q12-13. Οι μελέτες μας προτείνουν ότι η έκφραση hBub1 είναι περιορισμένη στα πολλαπλασιαμένος κύτταρα και εμφανίζεται να περιλαμβάνεται στη ρύθμιση της προόδου κύτταρο-κύκλων. Η μοριακή κλωνοποίηση hBub1 DNA θα διευκολύνει τη μελέτη του ρόλου της στον έλεγχο σημείων ελέγχου αξόνων καθώς επίσης και του πιθανού ρόλου της σε ορισμένες γενετικές αναταραχές.