The present invention relates to methods to engineer nicking endonucleases from existing Type IIs restriction endonucleases, and the production of the engineered nicking endonucleases. Two engineering methods are disclosed. One involves inactivating the dimerization function of a Type IIs restriction enzyme using site-directed mutagenesis approach. The other involves replacing the cleavage domain of a Type IIs restriction enzyme with the cleavage domain from a natural occurring nicking endonuclease, N.BstNBI.

Η παρούσα εφεύρεση αφορά τις μεθόδους στο μηχανικό που χαρακώνει τις ενδονουκλεάσεις από τις υπάρχουσες ενδονουκλεάσεις περιορισμού τύπων IIs, και την παραγωγή των κατασκευασμένων ενδονουκλεάσεων χαρακώματος. Δύο μέθοδοι εφαρμοσμένης μηχανικής αποκαλύπτονται. Το ένα περιλαμβάνει την αδρανοποίηση της dimerization λειτουργίας ενός ενζύμου περιορισμού τύπων IIs χρησιμοποιώντας την περιοχή-κατευθυνμένη προσέγγιση μεταλλαξιγένεσης. Αλλος περιλαμβάνει την αντικατάσταση της περιοχής σχισίματος ενός ενζύμου περιορισμού τύπων IIs με την περιοχή σχισίματος από μια φυσική ενδονουκλεάση χαρακώματος εμφάνισης, N.BstNBI.