A method for measuring heterodimerization of HIV RT, which comprises the
steps of:
a) providing a first solution comprising p66 subunit homodimers in the
presence of a dissociation agent; b) contacting the first solution with
p51 RT subunits and incubating in the presence of a reassociation buffer
to allow association of a complex of p66/p51 RT subunits, wherein one of
the subunits comprises an affinity tag and the other of the subunits
comprises a detectable label; c) contacting the incubate of step b) with
an affinity medium under conditions that enable the p66/p51 complex to
bind to the affinity medium; and d) determining the amount of complex
formed by measuring the level of detectable label bound to the affinity
medium (or by measuring the reconstituted RT polymerase activity). Steps
a) to d) can be carried out in the presence or absence of a test compound
followed by e) comparing the test compound sample to a control sample
lacking the compound, whereby modulated p66/p51 complex formation in the
test compound sample is indicative of the ability of the compound to
modulate, inhibit or enhance heterodimerization. The method can be used to
screen for inhibitors of HIV RT dimerization.
Um método para medir o heterodimerization de HIV RT, de que compreende as etapas: a) fornecendo uma primeira solução que compreende homodimers do subunit p66 na presença de um agente do dissociation; _ b) contat primeiro solução com p51 rt subunits e incubating presença um reassociação amortecedor para permit associação um complexo p66/p51 rt subunits, wherein um subunits compreend um afinidade Tag e outro subunits compreend um detectável etiqueta; c) contatando o incubate da etapa b) com um meio da afinidade sob as circunstâncias que permitem o complexo p66/p51 de ligar ao meio da afinidade; e d) determinar a quantidade de complexo deu forma medindo o nível do limite detectável da etiqueta ao meio da afinidade (ou medindo a atividade reconstituted do polymerase do RT). As etapas a) a d) podem ser realizadas na presença ou na ausência de um composto do teste seguido e) comparando a amostra do composto do teste a uma amostra de controle que falta o composto, por meio de que a formação p66/p51 complexa modulada na amostra do composto do teste é indicativa da abilidade do composto de modular, inibir ou realçar o heterodimerization. O método pode ser usado selecionar para inibidores do dimerization do HIV RT.
