The invention provides a process for preparing capped mRNAs from an RNA
mixture, e.g. whole RNA isolated from a cell or tissue extract, that
includes combining in a reaction mixture RNA comprising capped mRNA with a
separable affinity matrix having high-affinity eIF4E bound thereto, under
conditions sufficient for binding to occur between the high-affinity eIF4E
and the capped mRNA, whereby capped mRNA is bound to the affinity matrix,
separating the affinity matrix from the reaction mixture, then separating
the capped mRNA from the affinity matrix. High affinity eIF4E mutants
previously described are employed in the process as well as a novel mutant
disclosed and claimed herein. The mRNA preparation process is based on
isolation of 5'-capped mRNA. The mRNA molecules thus isolated have intact
sequences encoding the NH.sub.2 -terminal ends of the proteins they
encode, unlike those isolated by prior methods. In addition, use of the
method isolates mRNA sequences not isolatable by prior methods that relied
on binding to polyadenylated 3'-end sequences.
Η εφεύρεση παρέχει μια διαδικασία για καλυμμένο mRNAs από ένα μίγμα RNA, π.χ. ολόκληρο RNA που απομονώνεται από ένα απόσπασμα κυττάρων ή ιστού, που περιλαμβάνει το συνδυασμό σε ένα RNA μιγμάτων αντίδρασης περιλαμβάνοντας καλυμμένο mRNA με μια ευδιαχώριστη μήτρα συγγένειας που έχει την υψηλός-συγγένεια eIF4E συνδεδεμένη επιπλέον, υπό τους όρους ικανοποιητικούς για τη δέσμευση για να εμφανιστεί μεταξύ της υψηλός-συγγένειας eIF4E και το καλυμμένο mRNA, με το οποίο καλυμμένο mRNA είναι συνδεδεμένο στη μήτρα συγγένειας, που χωρίζει τη μήτρα συγγένειας από το μίγμα αντίδρασης, κατόπιν χωρίζοντας το καλυμμένο mRNA από τη μήτρα συγγένειας. Οι υψηλές μεταλλάξεις συγγένειας eIF4E που περιγράφονται προηγουμένως υιοθετούνται στη διαδικασία καθώς επίσης και μια νέα μετάλλαξη αποκαλυπτόμενες και που απαιτούνται εν τω παρόντι. Η διαδικασία προετοιμασιών mRNA είναι βασισμένη στην απομόνωση 5'-καλυμμένου mRNA. Τα μόρια mRNA που απομονώνονται έτσι έχουν τις άθικτες ακολουθίες κωδικοποιώντας το NH.sub.2 - τελικές άκρες των πρωτεϊνών που κωδικοποιούν, αντίθετα από εκείνους που απομονώνονται με τις προγενέστερες μεθόδους. Επιπλέον, η χρήση της μεθόδου απομονώνει τις ακολουθίες mRNA μη isolatable με τις προγενέστερες μεθόδους που στηρίχθηκαν στη δέσμευση οι ακολουθίες 3'-τελών.
